旋渦混合器在染色體標本的FISH技術的應用

　　（一）實驗目的
　　
　　1．掌握FISH技術的一般原理，及其基本實驗方法；
　　
　　2．了解FISH技術的發(fā)展概況，以及應用范圍。
　　
　　（二）實驗原理
　　
　　FISH是以分子雜交為基礎，應用非放射性熒光物質標記核酸探針，通過堿基互補的原理與靶DNA雜交，在核中或染色體上顯示靶DNA序列位置的方法。FISH技術可分為四個步驟：樣品制備、探針標記、雜交及其檢測。
　　
　　（三）實驗準備
　　
　　1．材料染色體標本或血涂片
　　
　　2．試劑甲醇、乙醇、乙酸、標記探針（生物素標記探針或地高辛標記探針）、3mol/L乙酸鈉、甲酰胺（分子生物學級和粗制品）、雜交緩沖液（4×SSC，20%硫酸葡萄糖）、鮭精DNA、磷酸鈉、Tween20、BSA、檢測液（5μg/ml熒光素偶聯的親和素或6μg/ml羅丹明偶聯的抗地高辛抗體）DAPI
　　
　　3．儀器低溫高速離心機、熒光顯微鏡、MixPlus旋渦混合器、移液器、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、烤箱
　　
　　（四）實驗方法與步驟
　　
　　1．探針混合與變性
　　
　　（1）混合20～60ng標記探針DNA和3～5μg鮭精DNA。反應后體積少于10μl，可直接凍干；若體積較大，可加1/20體積的3mol/L乙酸鈉和2倍體積100%乙醇沉淀DNA。混勻并于-70℃30min。在4℃，12000r/min離心10min，棄上清，沉淀物以300μl70%乙醇洗滌后在離心（同上），棄上清，凍干。
　　
　　（2）將DNA重懸于5μl去離子的甲酰胺中，室溫旋渦混勻3min。
　　
　　（3）加入5μl雜交緩沖液，,MixPlus旋渦混合器中混勻5min。
　　
　　（4）將DNA探針置于75℃水浴中變性5min。迅速置于冰浴中5min，備用。
　　
　　2．樣本處理
　　
　　（1）染色體制備標本或血涂片在室溫下依次用70%、90%、100%的乙醇脫水，各5min。涼干備用。
　　
　　（2）變性前將載玻片置60℃烤箱內孵育，目的是防止變性液加至載玻片時溫度降低。
　　
　　（3）將變性液在水浴箱中加熱至70℃。
　　
　　（4）將預熱的載玻片移至含變性液（70%去離子甲酰胺、2×SSC和50mmol/L磷酸鈉）的Coplin廣口瓶內2min。
　　
　　（5）立即將載玻片依次移入70%、90%和100%預冷的乙醇中，各5min。防止DNA復性。
　　
　　（6）空氣干燥。
　　
　　3．雜交
　　
　　（1）將10μl含變性探針的雜交混合液加至載玻片上變性的靶DNA上。
　　
　　（2）在雜交液上蓋上蓋玻片，防止產生氣泡。
　　
　　（3）用橡膠泥將蓋玻片四周封好，并置濕盒內37℃溫浴過夜。
　　
　　4．檢測
　　
　　（1）從濕盒內取出載玻片，除去橡膠泥。
　　
　　（2）將載玻片置于42℃預溫的漂洗液A（50%甲酰胺，2×SSC）中，在恒溫水浴搖床中振蕩10min，并使蓋玻片脫落。更換漂洗液A兩次，每次振蕩5min。
　　
　　（3）將載玻片移入60℃預溫的漂洗液B（1×SSC～0.1×SSC，pH7.0，根據實驗需要調整。），漂洗5min，更換漂洗液B兩次，每次5min。
　　
　　（4）將載玻片取出，甩盡液體，加200μl封閉液（3%BSA，4×SSC，0.1％Tween20），蓋上蓋玻片，防止氣泡產生，置于濕盒內，37℃溫浴30min以上。
　　
　　（5）移去蓋玻片，除去多余液體，加200μl檢測液（5μg/ml熒光素偶聯的親和素或6μg/ml羅丹明偶聯的抗地高辛抗體，緩沖液為1%BSA、4×SSC和0.1Tween20），在37℃濕盒內溫浴30min。
　　
　　（6）移去蓋玻片，將載玻片置于漂洗液C（4×SSC，0.1％Tween20，pH7.0）中，42℃振蕩漂洗3次，各5min。
　　
　　（7）將載玻片置于復染液（2×SSC，200ng/mlDAPI）中，室溫振蕩20min。
　　
　　（8）載玻片在漂洗液D（2×SSC，0.05%Tween20）中室溫溫育1min～2min。
　　
　　（9）熒光顯微鏡下觀察。